生物资源  2017, Vol. 39 Issue (6): 391-397  DOI: 10.14188/j.ajsh.2017.06.001

引用本文  

穆大帅, 卢德臣, 郑维爽, 等. 我国海洋细菌新物种鉴定与资源研发进展[J]. 生物资源, 2017, 39(6): 391-397.
MU Dashuai, LU Dechen, ZHENG Weishuang, et al. Advances in marine bacterial identification and resource development in China[J]. Biotic Resources, 2017, 39(6): 391-397.

基金项目

国家自然科学基金(31370057)

通讯联系人

杜宗军, E-mail:duzongjun@sdu.edu.cn

作者简介

穆大帅(1987-),男,讲师,研究方向为海洋微生物资源。E-mail:dashuai.mu@sdu.edu.cn

文章历史

收稿日期:2017-09-27
修回日期:2017-10-09
我国海洋细菌新物种鉴定与资源研发进展
穆大帅1,2 , 卢德臣2 , 郑维爽2 , 陈冠军1,2 , 杜宗军1,2     
1. 山东大学 微生物技术国家重点实验室,山东 济南 250100;
2. 山东大学(威海) 海洋学院,山东 威海 264209
0
摘要:近年来国际上对海洋微生物资源的发掘方兴未艾。本文综述了2000年以来我国在海洋细菌新物种鉴定与资源研发方面的进展,统计分析了国内相关单位海洋细菌新物种鉴定发表的数量及多样性,介绍了国内相关科研机构在海洋细菌系统学方面的工作进展,以及国内海洋微生物资源保藏与开发现状。比较了世界范围内海洋细菌系统学研究进展,并探讨了海洋细菌分离培养的主要方法,最后小结了我国海洋细菌资源研究领域存在的问题及未来发展的前景,为其进一步研发利用提供参考。
关键词海洋细菌    新物种    多样性    微生物资源    
Advances in marine bacterial identification and resource development in China
1. State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, Shandong, China;
2. College of Marine Science, Shandong University, Weihai 264209, Shandong, China
Abstract: In recent years, the exploration of marine microbial resources is under massive development. In this paper, we review the research progress of taxonomical studies in China by summarizing the types and diversity of newly published novel marine bacteria, the domestic institutes that specialized on marine microbial resource exploration, and the preservation methods and utilizations of marine bacteria. Meanwhile, we compare the progress of taxonomical studies between China and other countries, especially on the current methods of isolating novel marine bacteria. Finally, we summarize the opportunities and challenges on marine microbial resource research in China in order to bring new prospects to this field.
Key words: marine bacterium    novel species    diversity    microbial resource    
0 引言

海洋占据地球70.9%的表面积,占有地球总水体的97.0%左右,是地球上最重要的生态系统之一[1]。现有微生物分子生态学研究表明海洋中蕴藏大量微生物资源,这些微生物对地球物质循环、生态平衡和人类健康具有十分重要的意义[2]。海洋中绝大多数微生物尚不能用现有的培养方法和技术进行分离培养,这些微生物被称为未培养微生物(uncultured microorganisms)。研究和认识这些微生物的生物学特性和生态学功能,以及分离培养这些未培养微生物,是当今微生物学的重要任务。

微生物系统学和高通量测序技术的快速发展,促进了研究学者对海洋微生物多样性的认识。2007年Sorcerer Ⅱ Global Ocean Sampling (GOS) expedition项目中,海洋学家从采集的41份样品中发现了大量未知的海洋微生物资源[3];2013年Tara Oceans expedition项目对210个位点的3.5万份海水样本进行分析,发现了约3.7万种微生物(细菌和古生菌)[4]。这两大项目的开展为海洋微生物学研究提供了宝贵信息,也显示海洋中仍有大量微生物资源未可培养,有待开发。

近几年,随着微生物培养技术的发展和海洋微生物研究的深入,海洋中越来越多的微生物资源被发掘和利用,我国对海洋微生物系统学的研究也日渐深入,并取得了一定的进展。本文通过统计分析我国学者自2000年以来在海洋细菌资源学研究领域取得的进展,对我国的海洋细菌新物种鉴定及资源研发现状做一概述。其中统计数据来源于《国际系统与进化微生物学杂志》(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,简称IJSEM),包含其他杂志发表后经IJSEM生效发表(validation list)的新的分类单位。IJSEM是由普通微生物学会(Society for General Microbiology)出版的,国际微生物分类学界公认的一份微生物分类学领域权威性杂志。

1 自2000年以来我国海洋细菌新物种鉴定的研究进展 1.1 我国海洋细菌新物种发表情况

2000年代初,我国海洋微生物研究工作者开始零星地在IJSEM杂志上发表海洋微生物新物种。从2006年起,我国鉴定并公开发表的海洋微生物新物种数快速增加(图 1),2014年成为单一年份里生效发表数量最多的国家(79个),2015年我国公开发表的海洋微生物新物种超过100个,表明在我国海洋微生物资源发掘工作受到越来越多的重视,这也得益于近年来国家对海洋科研资助力度的不断增强。进一步统计发现,2000年1月至2017年7月期间,我国(含港澳台地区,下同)一共发表了约622个海洋原核微生物新物种(其中海洋细菌共577种,古菌45种),建立了2个目、8个科、约128个属(表 1)。同期,我国发表的来自陆生环境的原核微生物(细菌和古菌)新物种为1 570个,约为海洋新菌的2.7倍。图 1展示了我国原核微生物新物种及海洋细菌新物种的发表情况。由此看出,我国原核微生物新物种的发掘仍相对集中在陆生环境,这与我国国土面积辽阔,而涉海研究单位数量相对较少有关;也说明我国海洋微生物相关研究起步较晚,有待更多科研工作者投入其中。

图 1 我国发表的原核微生物及海洋细菌新种数量(2000.01-2017.07) Figure 1 Novel prokaryotic species and novel bacterial species of marine origins published by China(2000.01-2017.07)

表 1 我国发表的海洋细菌新目及新科概况(2000.01-2017.07) Table 1 New families and new orders of marine origins published by China (2000.01-2017.07)
1.2 我国发表的海洋细菌新物种的多样性分析

截至2017年5月,原核微生物标准命名列表网站(list of prokaryotic names with standing in nomenclature,LPSN)一共收录了36个门、106个纲、188个目、399个科、2 854个属以及15 626个物种(http://www.bacterio.net/-number.html)。目前已发现的36个门的生物中有34个门在海洋环境中有所分布,而陆生环境仅分布于17个门中,显示出海洋环境具有丰富的生物多样性[14]。Yarza等[15]在2014年通过对提交到SILVA(拉丁文silva意为森林)公共数据库(http://www.arb-silva.de)的16SrRNA基因的序列进行了分析,预测了包括可培养和不可培养原核微生物的分类,发现原核微生物大概能够分成1 768个门、3 400个纲、6 912个目、17 958个科、属多达至94 451个,这说明还有非常庞大数量的微生物未被培养。

对我国分离鉴定的577种海洋细菌进行多样性分析发现,在门分类水平上,已鉴定最多的微生物分布在变形菌门(Proteobacteria,占比51.0%),该类群也是海洋环境中数量最多的类群[4],其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)(图 2)。我国在陆地环境分离的微生物类群主要为变形菌门和放线菌门,拟杆菌门物种相对较少。这在一定程度上体现了海洋与陆地生境的不同,如拟杆菌可能更适合海洋的高盐、低温、低氧浓度等特殊环境,相对丰度较高,因而更容易从海洋环境中分离;另外,陆地和海洋微生物的分离培养方法的差异也可能对可培养微生物多样性产生一定影响。

图 2 我国发表细菌新种多样性的统计(2000.01-2017.07) Figure 2 Summary of novel bacterial species published by China on phylum level (2000.01-2017.07)
1.3 我国从事海洋细菌系统学研究的单位分布

在我国,从事海洋微生物新物种的筛选与鉴定的单位主要集中在沿海的大学和科研院所。自2000年以来,海洋细菌鉴定和发表数量最多的五家单位依次是国家海洋局第三海洋研究所(93个)、山东大学(74个)、中国海洋大学(50个)、江苏大学(43个)和中国科学院微生物研究所(30个)。表 2列出了我国大陆发表海洋微生物新物种数量大于10个的单位统计及分布情况。从图中可知,海洋微生物资源的分离与鉴定研究需要一定的地域条件,相关科研单位主要集中在沿海地区,方便海洋微生物样品的采集、运输、处理和保存。

表 2 中国大陆地区相关研究机构发表海洋微生物新种情况 Table 2 Marine novel prokaryotic microorganisms published in China mainland

对我国已发表的海洋微生物新种的分离地进行分析,发现这些新物种分离自近海环境样品的居多,主要分离自沿海地区的潮间带海洋沉积物、近海海水等,对深海、远洋及极地样品的分离主要集中在国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋局第一海洋研究所、中国科学院南海海洋研究所和中国海洋大学等几家具备远洋和深海采样能力的单位。从进行海洋微生物资源研究的单位分布及相关涉海单位样品来源看,目前我国海洋微生物资源的相关研究很大程度上依赖地理因素及航海、采样设备。目前,我国海洋调查船队已增加至近40艘,逐步形成了以“蛟龙”、“海龙”、“潜龙”为代表的“三龙”深海装备体系,特别是“蛟龙号”载人潜水器的应用,显著提高了精确获取生物样品的可能性和准确性,期待未来几年中国在海洋微生物资源发掘的研究中取得更大突破。

1.4 我国海洋微生物资源保藏情况

菌种保藏是微生物资源开发利用的基础,具有重要的战略意义。在2004年之前我国对海洋微生物菌种的保藏基本由各个科研单位自行保藏。2004年后,中国海洋微生物菌种保藏管理中心(Marine Culture Collection of China, MCCC)作为牵头单位承担了科技部“海洋微生物资源整理、整合与共享试点”项目,整合了包括国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋局第一海洋研究所、国家海洋局第二海洋研究所、中国极地科学研究中心、中国海洋大学、厦门大学、山东大学、中科院微生物所、青岛科技大学、华侨大学、中山大学等多家涉海科研机构的海洋微生物菌种资源。经过10余年的建设,发展成为我国最具有代表性的海洋微生物菌种保藏管理中心,具备了微生物菌种的保藏、管理与服务的各项功能。目前库藏海洋微生物2.2万株,涵盖3 400多个种,成为世界领先的海洋微生物菌种保藏管理中心(http://www.mccc.org.cn/)。另外其他地区也根据自己的研究和经济发展需要建立了相应的海洋微生物资源平台,如山东省海洋微生物菌种库资源平台(https://sdum.wh.sdu.edu.cn/index.html),该资源平台保藏海洋细菌10 000余株,分布于400多个属,2 500多个物种。

1.5 我国海洋微生物资源开发研究进展

2017年7月22日,国家海洋局在厦门举行新闻发布会,发布了我国开展深海大洋生物资源探测开发15年来取得的重要成果。在海洋微生物资源方面,获得一批深海知识产权,在医药、环保、工业、农业等领域展现出良好的应用前景。完成了4 000多株微生物资源在海洋药物、生物农药、环境保护、生物技术、工业酶应用等方面的潜力评估,申请国际国内发明专利200多项;建立海洋微生物中试平台;多项研究成果已经完成应用示范,部分实现了产业化应用。

2014年,国家海洋局第三海洋研究所邵宗泽研究员团队首次全面解析了海洋烷烃降解细菌降解利用烷烃的调控网络,包括从感知烷烃、趋化作用、信号转导到吸收烷烃并实现烷烃降解的一系列调控网络[16];山东大学微生物技术国家重点实验室张玉忠教授课题组研究了海洋细菌产生的二甲基巯基丙酸(DMSP)裂解酶DddQ的性质,解析了DMSP裂解酶DddQ与抑制剂及底物的复合物晶体结构,结合分子动力学模拟和一系列生化实验,阐明了DddQ催化DMSP裂解产生DMS的动态过程及分子机制[17]。该研究结果首次揭示了DMSP裂解酶催化DMSP裂解产生DMS的机制,研究结果对进一步分析全球DMS的产生及其对气候的影响具有重要意义;2016年,上海交通大学王风平教授研究团队解析了深部生物圈“深古菌”中部分类群的特殊代谢机制和生物地球化学功能。首次发现和通过酶学功能检测证实古菌具有自养产乙酸的代谢方式,极大地拓展了对古菌代谢多样性的认识[18];2017年中国海洋大学海洋生命学院张晓华教授和英国东英吉利大学Jonathan D.Todd博士合作研究发现自我国东海水体分离得到的团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia aggregata)及其他多种海洋细菌也可以合成DMSP[19],这是首次发现海洋异养细菌可以合成DMSP。他们进一步从团聚拉布伦茨氏菌中鉴定出了DMSP合成的关键基因,拓展了人们对海洋中DMSP生物合成的认识。此外,中国海洋大学有几个研究团队从海洋微生物中筛选系列海藻多糖降解酶,包括褐藻胶裂解酶、卡拉胶水解酶、琼脂糖水解酶等,阐明其酶学性质、构效关系和作用机制[20],并利用这些酶建立海洋活性寡糖规模化制备技术体系,对我国资源丰富的海藻多糖的高值化利用具有重要的应用价值。最近,中科院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室联合其他科研单位报道了从深海放线菌中发现了具有抗结核杆菌系列活性物质,通过生物合成技术优化改造获得低细胞毒活性、强抗结核杆菌活性的化合物怡莱霉素E[21]。这些研究表明,在前期积累的丰富的海洋微生物菌种资源基础上,我国对海洋微生物资源的研发已经逐渐深入,期待未来几年,我国在海洋微生物资源的开发利用上取得更大成就。

2 2000年以来全球海洋细菌新物种鉴定现状及我国在该方面研究所占比例 2.1 全球范围新鉴定的海洋细菌数量及多样性分析

2000年1月至2017年7月,世界范围内一共发表了约2 411个海洋细菌新物种,占该期间全部原核微生物新种的24.7%。从门水平上分析,鉴定发表的海洋细菌主要类群是变形菌门(1 187个,占总海洋细菌新种49.2%),拟杆菌门(519个,占比21.5%),放线菌门(249个,占比10.3%)和厚壁菌门(175个,占比7.2%)(图 3)。Sunagawa等[4]利用宏基因组技术分析了Tara国际大洋采集计划中243个海洋样品中的原核微生物组成,发现海洋环境中数量上占前5位的门类分别是变形菌门,拟杆菌门,放线菌门,蓝细菌门(Cyanophyta)和浮霉菌门(Planctomycetes)。其中含量相对丰富的蓝细菌门、浮霉菌门和绿弯菌门(Chloroflexi)目前被培养鉴定的类群较少,国内外相关研究基本处于空白。这些类群在海洋生态系统稳定和全球物质循环中担当的角色还不清楚,需要科研人员改良或重新设计分离培养方案,以期能够在蓝细菌门、浮霉菌门和绿弯菌门类群中获得更多可培养物种资源,加深人们对海洋微生物资源和功能多样性的认识。

图 3 世界范围内发表的海洋原核微生物种类分布比率(2000.01-2017.07) Figure 3 The rate of novel marine prokaryotic microbial species on phylum level published around the world (2000.01-2017.07)
2.2 从事海洋微生物系统学研究的主要国家

2000年以来,国际上从事海洋微生物系统学研究的国家主要集中在韩国(发表海洋细菌新物种695个)、中国(577个)、日本(280个)和俄罗斯(142个),其发表的海洋微生物新物种约占到总数的65.6%。其中韩国在海洋微生物资源发掘方面的研究起步相对较早,截至目前,其发表的海洋微生物新物种数量仍居第一位,占到总数的26.1%(图 4)。但是我国从2014年已经成为单一年份鉴定发表海洋新菌最多的国家(79个),且近几年一直保持该优势(表 3)。

图 4 各个国家海洋原核微生物鉴定发表的数量分布比率(2000.01-2017.07) Figure 4 The rate of published marine novel prokaryotic microorganisms in different counties (2000.01-2017.07)

表 3 国际上发表海洋微生物新物种的主要国家 Table 3 Major countries for the publication of novel species of marine origins
3 海洋细菌的分离培养方法

海洋中蕴含丰富的微生物资源,由于目前分离培养技术有限,可培养的微生物只占很少一部分,可培养微生物的多样性也有限,海洋中其他主要类群如浮霉菌门和绿弯菌门还少有类群被纯培养。

为培养出更多的微生物物种,近年来研究人员进行了很多尝试,例如Epstein和Lewis团队开发了“扩散盒”培养法,该方法可提高对海洋潮间带底泥微生物的分离效率[22]。分离芯片(iChip)是对“扩散盒”的升级,研究人员用该方法从土壤中筛选出了一种新的微生物(Eleftheria terrae),还发现这种微生物能够分泌新型抗生素teixobactin[23]。将自然环境带到实验室中是模拟原始生存环境的一种策略,相关研究也取得一定成效:SAR11类群的分离便是该策略成功的典型[24];细胞微囊包埋技术同样分离到大量未培养微生物[25],在国内,刘双江团队也对类似分离技术进行创新,得到了部分新的微生物类群[26]

目前从我国在海洋原核微生物分离培养的方法来看,2000年以来我国发表的500多个海洋细菌中,大部分是通过用Marine Agar 2216作为分离培养基分到的,还有部分使用ISP[27]、NHM[28]、PY[29],或是R2A培养基[30]等。分离培养基的多样性将直接影响可培养微生物的多样性,最近研究表明,采用培养组学进行微生物的分离培养能够获得更多难培养和未培养的类群[31],说明在未培养海洋微生物的可培养研究过程中,应用多种培养策略,开发新型培养基仍是很有必要的。

除了培养基,其他处理条件对微生物的可培养性也有重要影响。如样品的前期处理环节也易被忽视,大多数实验室采用直接将样品稀释涂布的方法分离海洋细菌。山东大学杜宗军教授课题组发表的很多新物种是采用先富集后分离的方法获得的[5]。海洋中大多数微生物处于活的非可培养状态,并有部分微生物由于长期适应原生境,当新生境(人工培养基)出现,会出现较长的代谢调整期。为了缩短部分微生物对新生境的调整期,或者唤醒其中休眠的微生物类群,我们认为可以采用富集组学的方法来开展菌种分离工作。通过设计多种富集培养策略(不同的富集培养基和不同的富集培养条件),采用多相富集技术以期分离到更多微生物类群。通过与多组学技术相结合来解析富集分离机制,改进并设计定向富集分离策略,相信富集组学技术将会在海洋微生物菌种资源发掘中发挥重大作用。当然分离培养策略远不止上述几种方法,仍需要进行创新和改良。

4 小结

我国海洋细菌资源研究目前还存在着较多的限制因素,主要有两点:其一,从目前我国从事海洋细菌研究的单位分布统计来看,海洋样品的采集依赖地域及航海设备,难度较大(如深海海水和深海海洋沉积物样品,以及多种海洋生物如珊瑚、海绵等),限制了研究单位和研究人员的参与程度;其二,海洋细菌资源研究力量相对薄弱,且在海洋细菌分离方法的研究上缺乏原始创新。建立有效的分离培养方法是发掘海洋细菌资源的关键。由于目前大多数难培养菌的可培养机制尚不清楚,这极大地限制了海洋环境中细菌资源的复苏、培养和挖掘。

随着我国“十三五”期间对海洋事业发展的投入持续增加,相关课题组需加强联合,发挥各自优势,加大对各类海洋环境微生物资源的发掘。可以预见,随着分离培养技术的发展和完善,我国科研工作者在海洋微生物资源发掘方面将会取得越来越多的成绩,服务于我国海洋发展战略。

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