生物资源  2017, Vol. 39 Issue (6): 406-412  DOI: 10.14188/j.ajsh.2017.06.003

引用本文  

王鹏, 曹海岩, 李春阳, 等. 海洋微生物裂解二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)的酶促催化机制[J]. 生物资源, 2017, 39(6): 406-412.
WANG Peng, CAO Haiyan, LI Chunyang, et al. Catalytic mechanisms of marine microbial enzymes for dimethylsulfoniopropionate (DMSP) cleavage[J]. Biotic Resources, 2017, 39(6): 406-412.

基金项目

国家自然科学基金重点项目(31630012);山东省泰山学者计划(TS20090803);全国博士后创新人才支持计划(BX201600095;BX201700145)

通讯联系人

陈秀兰, E-mail:cxl0423@sdu.edu.cn

作者简介

王鹏(1990-),男,博士,现主要从事海洋微生物代谢。E-mail:wangdaipeng31@gmail.com

文章历史

收稿日期:2017-09-21
修回日期:2017-10-19
海洋微生物裂解二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)的酶促催化机制
王鹏1 , 曹海岩1 , 李春阳1 , 陈秀兰1,2     
1. 山东大学 微生物技术国家重点实验室,山东 济南 250100;
2. 山东大学 海洋生物技术研究中心,山东 济南 250100
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摘要:二甲基巯基丙酸内盐(dimethylsulfoniopropionate,DMSP)是全球硫循环和碳循环的重要载体物质。海洋浮游植物、大型藻类和临海被子植物是DMSP的主要生产者。每年DMSP的产量可以达到1×109吨。在北大西洋表面的某些区域,DMSP的产量可以达到碳固定总量的10%。微生物介导的DMSP的裂解是全球硫循环和碳循环的重要步骤。目前,8种参与裂解DMSP的DMSP裂解酶已被报道。在已发现的8种DMSP裂解酶中,3种DMSP裂解酶的催化机制得到了研究和阐明。本文根据国内外研究成果,主要对DMSP裂解过程的酶促催化机制的研究进展进行综述,认为在今后工作中需要继续发现新的DMSP裂解酶,并进一步揭示海洋微生物裂解DMSP的分子机制。
关键词海洋微生物    二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)裂解    酶促催化机制    
Catalytic mechanisms of marine microbial enzymes for dimethylsulfoniopropionate (DMSP) cleavage
1. State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, Shandong, China;
2. SThe Marin Biotechnology Research Center, Jinan 250100, Shandong, China
Abstract: Dimethylsulfoniopropionate (DMSP), produced on a scale of 1×109 tons a year by marine phytoplankton, microalgae and a few marine angiosperms, is a major participant in the global sulfur and carbon cycles. In some areas of the ocean surface of the North Atlantic, DMSP can account for 10% of the fixed carbon. Microbial cleavage of DMSP is an important step in global sulfur and carbon cycles. Up to now, eight kinds of DMSP lyases have been identified and three of these lyases have been studied and deciphered in mechanism. Here, we review the progresses in the catalytic mechanism of DMSP cleavage and think that more new DMSP lyases should be identified and new molecular mechanisms for DMSP cleavage by marine microbial enzymes should be further revealed in the future.
Key words: marine microorganism    dimethylsulfoniopropionate(DMSP) cleavage    enzymatic catalytic mechanism    
0 引言

二甲基巯基丙酸内盐(dimethylsulfoniopropionate,DMSP)是一种叔锍两性化合物(图 1)。它是海洋硫循环中重要的载体物质,每年的产量多达1×109[1]。在大洋表面的某些区域,DMSP的产量可以占据整个碳固定量的10%[2, 3]。DMSP一直被认为主要由海洋单细胞浮游植物、海藻、临近海边生长的被子植物和珊瑚虫等真核生物产生[4~6]。近来研究发现原核的细菌也可以产生DMSP[7]。DMSP在海水中可以达到纳摩尔量级,DMSP主要来源于合成DMSP的藻类细胞衰老、死亡或被病毒裂解后DMSP的释放[8, 9]

图 1 二甲基巯基丙酸内盐的化学结构 Figure 1 Chemical structure of dimethylsulfoniopropionate

DMSP具有重要的生理功能。对海洋生物而言,DMSP不仅是一种重要的硫源和碳源,还被认为是一种重要的抗应激相容性溶质,具有渗透压保护、氧胁迫清除和防冻等生理功能[1]。因此,很多微生物会通过吸收海水中的DMSP达到在胞内进行积累。很多生物的胞内,DMSP浓度可达毫摩尔量级[8, 9]

很多微生物不仅能够积累DMSP,还能裂解DMSP。这一裂解过程不仅为海洋营养和全球硫循环提供了主要驱动力,而且连接起了生物硫库和非生物硫库并推动了陆地硫库、海洋硫库和大气硫库的流转[4]。同时,DMSP裂解代谢产生的二甲基硫(dimethyl sulfide,DMS)还具有重要的生态学功能。DMS和它的氧化产物是云形成的重要凝结核。DMS可以通过调节全球云量影响地球对太阳辐射的反射率从而影响全球气候[10, 11]

研究海洋微生物对DMSP的裂解,有助于我们更好地认识DMSP,以及地球硫循环和碳循环过程。本文将从DMSP裂解酶以及DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制等方面对DMSP的裂解代谢进行综述,并为DMSP代谢的进一步研究提出建议。

1 二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)裂解酶

目前已报道的DMSP裂解酶一共有8种,分别为DddD、DddP、DddL、DddQ、DddW、DddK、DddY和Alma1[4, 12, 13]。①按照功能可以分为两类。其中DddD单独分为一类,其余7种为一类。DddD裂解DMSP产生DMS和3-羟基丙烯(3-HP),而其他DMSP裂解酶则裂解DMSP产生DMS和丙烯酸[4]。②按照来源也可以分为两类。Alma1单独为一类,其余7种为一类。Alma1来自于真核的赫氏颗石藻,而其他DMSP裂解酶则主要来自于细菌[12]。也有例外,在某些子囊真菌中也发现了原本只出现在细菌中的编码DMSP裂解酶的基因,这些基因很可能主要来自于基因的水平转移[4, 14]。③按照细胞定位也可以分为两类。DddY单独分为一类,其余7种为一类。DddY定位于周质空间,而其他DMSP裂解酶则定位于胞内[4, 12]。④按照生物信息学可以分为五类,其中DddL、DddQ、DddW、DddK(13×103~26×103)属于cupin超家族,序列中含有保守的cupin基序[4, 13, 15]。DddD(约93×103)属于Ⅲ型辅酶A转移酶家族,反应过程需要乙酰辅酶A的参与[4, 16, 17]。DddP(约50×103)属于M24金属蛋白酶家族[4, 14]。Alma1(约32×103)属于氧化还原敏感的天门冬氨酸消旋酶超家族[18]。而DddY在序列上与其他已知功能的蛋白都没有相似性,暂时未定家族[19]。不同的DMSP裂解酶在性质上有很大区别,因此在催化机制上也有很大差异。

2 微生物对DMSP的裂解

除少数单细胞藻类能够裂解DMSP外[18],海洋中DMSP主要是通过细菌裂解[4]。虽然第一个发现的能够裂解DMSP的菌株来自厚壁菌门(Firmicutes),但是到目前为止发现的裂解DMSP的细菌主要来自变形菌门(Proteobacteria)。变形菌门根据16S rRNA基因序列分为α-、β-、γ-、δ-和ε-变形菌纲。裂解DMSP的菌株在γ-变形菌纲和α-变形菌纲中分布非常广泛,而在β-变形菌纲、δ-变形菌纲和ε-变形菌纲中分布较少。其中,海洋玫瑰杆菌和SAR11这两种在海洋表层海水中分布最广、丰度最高的细菌类群,是裂解DMSP的主力[4]

微生物对DMSP的裂解有两条通路,其中DddD将DMSP裂解成3-HP和DMS,DddP、DddQ、DddL、DddW、DddK、DddY、Alma1则将DMSP裂解成丙烯酸和DMS(图 2)[4, 12, 20]。当DMSP被裂解成3-HP、丙烯酸和DMS后,DMS会被释放到胞外,而3-HP和丙烯酸则会被进一步代谢。3-HP、丙烯酸主要通过两条途径进行代谢。在其中一条途径中,3-HP和丙烯酸主要在辅酶A连接酶PrpE、烯酰辅酶A还原酶AcuI和烯酰辅酶A水合酶AcuH的作用下,通过进入到甲基丙二酰辅酶A途径代谢。在另一条途径中,3-HP和丙烯酸则主要在乙醇脱氢酶DddA、乙醛脱氢酶DddC的作用下产生乙酰辅酶A进入到三羧酸循环进行代谢(图 2)[4, 12]

图 2 微生物对二甲基巯基丙酸内盐的裂解通路[20] Figure 2 Microbial cleavage pathways for dimethylsulfoniopropionate[20]
3 DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制

到目前为止,共有3种DMSP裂解酶的催化机制得到了阐明,它们分别是DddQ、DddP以及DddK[13, 21~23]

DddQ是cupin超家族DMSP裂解酶的代表,是海洋中分布最广最丰富的DMSP裂解酶之一[15],这表明DddQ在DMSP降解中发挥了举足轻重的作用。DddQ是Todd等[15]于2011年发现,并检测了生化活性。截至目前,在结构解析和生化验证的基础上,有两种不同的DddQ催化DMSP裂解的分子机制被提出。Li等[21]认为DddQ分子中结合一个Zn2+离子作为辅基,且当DddQ不结合DMSP分子时,关键的Tyr131残基与Zn2+离子形成配位。当DMSP与DddQ结合后,DMSP取代Tyr131与Fe3+离子的配位,使得Tyr131苯酚化并发生构象偏转靠近DMSP的Cα,从而使得Tyr131为催化碱,攻击DMSP的Cα,催化DMSP的β消除(图 3A)。Brummett等[23]则认为DddQ分子中主要结合一个Fe3+离子作为辅基,且当DddQ不结合DMSP分子时,水分子占据着与Fe3+离子配位的位置。当DMSP进入到DddQ的催化腔后,DMSP在His123、Tyr131和Tyr120等三个氨基酸残基的帮助下以正确的构象与DddQ结合并取代水分子与Fe3+离子形成配位,之后Tyr120作为催化碱,攻击DMSP的Cα,催化了DMSP的β消除(图 3B)。

图 3 DddQ可能的催化机制[21, 23] Figure 3 Proposed catalytic mechanism of DddQ[21, 23] 注:A,Li等[21]提出的DddQ的催化机制; B,Brummett等[23]提出的DddQ的催化机制 Note:A, catalytic mechanism proposed by Li et al[21]; B, catalytic mechanism proposed by Brummett et al[23]

DddK于2016年被Sun等[13]发现。Sun等[13]检测了DddK的活性并检测了DddK的Km等生化参数。虽然DddK与DddQ同属于cupin超家族DMSP裂解酶,但是DddK来自于SAR11类群而非DddQ所处的海洋玫瑰杆菌类群,且DddK拥有相对于其他DMSP裂解酶而言更高的Km值。Schnicker等[24]对DddK的结构进行了研究。他们认为DddK在自然状态下结合两个金属离子(Fe3+离子和Zn2+离子),但是当DddK结合一个Ni2+离子时酶活最高。在此基础上,他们以结合Ni离子的DddK为例,探讨了DddK催化DMSP裂解的机制。Schnicker等提出的DddK的催化机制与李春阳等人提出的DddQ的机制类似,都存在酪氨酸构象的变化和苯酚化。当DddK不结合DMSP分子时,关键的Tyr64残基与Ni离子形成配位。当DMSP与DddK结合后,DMSP取代Tyr64与镍离子的配位,使得Tyr64苯酚化并发生构象偏转,靠近DMSP的Cα,从而使得Tyr64为催化碱,攻击DMSP的Cα,催化DMSP的β消除(图 4)[24]

图 4 DddK可能的催化机制[24] Figure 4 Proposed catalytic mechanism of DddK[24]

与DddQ和DddK都不同,DddP是来源于M24金属蛋白酶家族的DMSP裂解酶。DddP在海洋中同样具有相当高的丰度[4, 12, 15]。Kirkwood等[25]探讨了DddP的生化性质。Hehemann等[26]以及王鹏等[22]先后解析了DddP的结构,王鹏等在结构分析及生化验证的基础上进一步提出了DddP催化DMSP裂解的机制[22]。在不结合DMSP的时候,在DddP的催化中心,Asp(295、297、307)、His371、Glu(406、421)和一个水分子共同螯合着两个Fe离子辅基Fe1和Fe2。其中,Glu421与Fe1和Fe2都有相互作用(图 5)。当DMSP分子在Trp95和Tyr(117、366)这三个氨基酸的帮助下以正确的取向进入到催化中心后,Fe1受其自身与DMSP羧基静电相互作用的影响,向DMSP移动0.9 Å,吸附到DMSP分子上。这一吸附减弱了Fe1与Glu421之间的相互作用并活化了DMSP的Cα氢和Asp377的羧基侧链。被活化了的Asp377的羧基作为亲核攻击碱攻击DMSP的Cα。在这一亲核攻击之后,伴随着Asp377的O-H键的形成,DMSP的α氢被释放且DMSP的C-S键被极化并迅速断裂,接着,Cα=Cβ双键形成。这一过程之后DddP催化DMSP裂解产生了DMS和丙烯酸(图 5)[22]

图 5 DddP可能的催化机制[22] Figure 5 Proposed catalytic mechanism of DddP[22]

DddP与来自于cupin超家族的DddQ/DddK结构不同,金属离子辅基不一样,催化过程和机制也完全不同。在DddQ/K中,DMSP取代Tyr与金属离子的配位,使得Tyr苯酚化并发生构象偏转靠近DMSP的Cα,从而使得Tyr131为催化碱催化DMSP的β消除[21, 24]。而在DddP中,Fe1的移动使得DMSP Cα氢的酸性增加,增加了Asp的攻击性,因而以Asp为催化碱攻击DMSP的Cα,催化DMSP进行β消除。DddQ/K催化的过程中存在氨基酸侧链构象的变化而没有金属离子移动,而DddP催化的过程中不存在氨基酸侧链构象的变化而存在金属离子移动。

除DddQ、DddK和DddP外,其他DMSP裂解酶都没有得到晶体结构解析。由于缺乏结构数据,这些DMSP裂解酶的催化机制尚没有被阐明,但是在生物信息学分析和生化验证的基础上,这些DMSP裂解酶催化机制的研究也取得了一些进展。

DddD属于Ⅲ型辅酶A转移酶家族,也是唯一催化DMSP裂解产生3-HP的DMSP裂解酶[4, 16, 17]。Alcolombri等[16]利用生物信息学和生化实验手段,尝试对DddD结构和催化机制进行了探讨。他们首先异源表达并纯化了来自海单胞菌(Marinomonas sp. MWYL1)的DddD,检测了DddD的生化活性,提出DMSP和乙酰辅酶A是DddD的天然底物。接着,他们借助Swiss-Modle软件模拟出了DddD的结构并预测出DddD的C端结构域很可能参与催化。最后,通过突变验证,他们提出Asp602是DddD催化裂解DMSP的催化残基(图 6)[16]

图 6 Alcolombri等[16]模拟出的DddD结构 Figure 6 Structure of DddD modelled by Alcolombri et al[16] 注:D602是催化反应进行的氨基酸残基 Note:D602 is the key residue for catalysis

不仅如此,Alcolombri等[18]也对来源于颗石藻的属于氧化还原敏感的天门冬氨酸消旋酶超家族的Alma1的催化机制进行了探讨。他们首先对来源于赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)的Alma1进行了异源表达纯化和生化性质分析,然后对Alma1进行了结构模拟。结构模拟显示Alma1的拓扑结构与天门冬氨酸消旋酶超家族的典型的拓扑结构类似,且预测出Cys108和Cys265很可能参与Alma1的催化(图 7)[18]

图 7 Alma1结构及预测出的两个关键氨基酸残基Cys108和Cys265[18] Figure 7 Modelled structure of Almal with two predicted key residues Cys108 and Cys265[18]
4 展望

到目前为止,虽然关于DMSP的裂解及DMSP裂解酶的研究取得了显著进展,但由于缺乏晶体结构,尚有5种DMSP裂解酶(DddD、DddW、DddL、DddY和Alma1)催化DMSP裂解的机制尚未得到充分的揭示。在这5种酶中,尤其是DddD、DddY和Alma1的催化机制还需要研究,因为它们具有一些完全不同于已阐明机制的DMSP裂解酶的性质。其中,DddD裂解DMSP不产生丙烯酸,DddY定位于周质空间且底物亲和力强,而Alma1是唯一来自于藻类的DMSP裂解酶。不仅如此,由于DMSP裂解菌分布广泛,所处生态环境多样,因此很有可能还有其他种类的DMSP裂解酶等待被发现,机制等待被阐明。

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