武汉大学学报(医学版)   2018, Vol. 39Issue (3): 421-426   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.1067.
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引用本文 

张诗琴, 赵旻, 刘子铭, 马于林, 周煜, 万静. 血浆miRNA-143/145:冠心病潜在生物标志物[J]. 武汉大学学报(医学版), 2018, 39(3): 421-426. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.1067.
ZHANG Shiqin, ZHAO Min, LIU Ziming, MA Yulin, ZHOU Yu, WAN Jing. miRNA-143/145 in Plasma:Potential Biomarkers of Coronary Artery Disease[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2018, 39(3): 421-426. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.1067.

作者简介

张诗琴,女,1993-,医学硕士生,主要从事冠心病相关研究,E-mail:515581716@qq.com

基金项目

国家自然科学基金资助项目(编号:81670409)

通讯作者

万静, 女,1972-,医学博士,教授,主任医师,主要从事冠心病临床与基础研究,E-mail:wanjing320@aliyum.com

文章历史

收稿日期:2017-11-06
血浆miRNA-143/145:冠心病潜在生物标志物
张诗琴 1, 赵旻 2, 刘子铭 1, 马于林 1, 周煜 2, 万静 1     
1. 武汉大学中南医院心血管内科 湖北 武汉 430071;
2. 武汉大学基础医学院病原生物学系 湖北 武汉 430071
[摘要] 目的: 探讨血浆miRNA-143/145水平与冠心病严重程度之间的关系。方法: 本研究共纳入273例行冠脉造影的患者,根据血管病变程度、病变支数、SYNTAX评分、疾病类型等进行分类,通过RT-PCR检测血浆miRNA-143/145表达水平并进行分析。结果: 与非冠心病患者相比,冠心病患者的血浆miRNA-143/145表达水平显著下降(miRNA-143,P<0.000 1;miRNA-145,P<0.000 1)。在多变量线性回归分析中,三支血管病变、较高的SYNTAX评分及ST抬高型心肌梗死患者的miRNA-143/145表达显著下降。此外,比较仅有冠状动脉粥样硬化患者与心肌桥患者或正常患者间的差异,发现前者的血浆miRNA-143/145表达水平显著下降。结论: 血浆miRNA-143/145表达水平与冠心病严重程度显著相关,对冠状动脉粥样硬化的患者也有重要的预测价值,可作为评估冠状动脉粥样硬化程度的生物标志物。
关键词miRNA143/145    冠心病    生物标志物    
miRNA-143/145 in Plasma:Potential Biomarkers of Coronary Artery Disease
ZHANG Shiqin1, ZHAO Min2, LIU Ziming1, MA Yulin1, ZHOU Yu2, WAN Jing1     
1. Dept. of Cardiovascular Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China;
2. Dept. of Pathogeniology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, China
[Abstract] Objective: To investigate the relationship between the expression of miRNA-143/145 in plasma and the severity of coronary artery disease(CAD). Methods: A total of 273 patients who underwent coronary angiography were enrolled in this study. The expression of miRNA-143/145 in plasma was quantified by RT-PCR and assessed by the severity of coronary atherosclerosis, the number of diseased vessels, the SYNTAX score and the disease diagnosis. Results: The expression of miRNA-143/145 in plasma was significantly lower in CAD patients than those without CAD(miRNA-143, P < 0.000 1; miRNA-145, P < 0.000 1). By multivariate linear regression analysis, the three-vessel disease, the higher SYNTAX scores, and STEMI patients were significantly associated with lower plasma levels of miR-143/145. In addition, the expression of miRNA-143/145 was found to be significantly different between patients with coronary atherosclerosis and myocardial bridges or normal patients. Conclusion: The expression of miRNA-143/145 in plasma is significantly associated with the severity of CAD and has important predictive value for coronary atherosclerosis patients, it can be used as biomarkers to evaluate the severity of coronary atherosclerosis.
Key words: miRNA143/145    Coronary Atherosclerotic Disease    Biomarker    

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease,CAD)是危害人类健康的重要疾病,在全世界的人群中具有很高的发病率和致死率[1-3]。动脉粥样硬化是冠心病的主要基础病因,被认为是一个慢性炎症过程,很多炎性标志物参与这一过程,如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-18(IL-18)等[4],但这些标志物往往缺乏特异性。miRNA是高度保守的单链非编码RNA,平均18-24个核苷酸,通过特异性结合mRNA的3′-UTR片段调节基因表达[5]。越来越多的研究表明,循环miRNA可能参与了冠心病的发生过程及动脉粥样硬化形成的病理生理过程,一些循环miRNA被认为是潜在的疾病诊断生物标志物,甚至可能成为限制动脉粥样斑块形成,使斑块趋于稳定的一个治疗靶标[6-8]。其中miRNA-143/145参与调控血管平滑肌细胞的表型转化,尤其是miRNA-145在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)中高表达,使血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化进展过程中发挥重要作用,从中突出了miRNA-143/145作为心血管疾病潜在生物标志物的重要性[9]。本研究旨在探讨血浆miRNA-143/145表达水平与冠心病严重程度之间的关系。

1 资料与方法 1.1 一般资料

入选2016年10月到2017年5月在武汉大学中南医院介入室接受冠状动脉造影检查的患者273名,其中冠脉造影未见狭窄者或结果仅为心肌桥者共66名,有冠脉病变者207名,年龄36-85(63.5±10.4)岁。

排除标准:合并有肝或肾功能衰竭,合并感染、肿瘤或结缔组织疾病者,合并先天性心脏病,合并出血性疾病或外周血管疾病的患者排除在外。

该研究方案由武汉大学中南医院伦理委员会批准,并在术前告知患者并签署知情同意书。

1.2 冠状动脉粥样硬化病变程度评估及临床分类

冠状动脉造影主要采用武汉大学中南医院心导管介入室仪器,经桡/股动脉入路,用于诊断患者冠脉病变程度。由至少两位经验丰富的心血管介入医师对冠状动脉狭窄程度进行评价。

临床分类:①根据血管病变程度分类:主要病变血管(左主干,左前降支,左回旋支,右冠)狭窄小于50%为轻度病变,50%-70%为中度病变,大于70%为重度病变;②仅为心肌桥或无冠脉病变患者及冠状动脉粥样硬化患者(即主要病变血管狭窄小于50%);③根据血管病变支数分类:左主干和(或)左前降支,左回旋支,右冠;④根据SYNTAX评分进行分级,分为小于23分,23-32分及大于32分三组;⑤根据疾病类型进行分组,分为无冠心病组(NON-CAD),稳定性心绞痛组(stable angina,SA),不稳定性心绞痛/非ST段抬高型心肌梗死组(unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction,UA/NSTEMI)及ST段抬高型心肌梗死组(ST-elevation myocardial infarction,STEMI)。

1.3 血浆标本采集

在患者桡动脉穿刺成功后置入鞘管,抽取动脉血5-10 ml,置于含EDTA的采血管中,将收集到的血液1 900 g,4 ℃离心10 min以移去血细胞,然后16 000 g,4 ℃离心10 min以移去细胞碎片,然后将血浆-80 ℃保存。

1.4 血浆miR-143/145测定

取400 μl上述血浆,加1 000 ml trizol后加入20 pmol外参(cel-miR-39),然后用Trizol法(Ambion公司)提取血浆总RNA,用Nano Drop 2 000测定总RNA浓度,取100 μg总RNA利用反转录试剂盒(Promega公司)合成cDNA,然后取1 μl作为模板,用DBI RT qPCR试剂盒检测miRNA-143/145的表达量。采用相对循环阈值(Ct)表示,RT-qPCR结果采用2-[Ct(miR-143/145)-Ct(cel-miR-39)]方法进行分析。

1.5 统计学分析

通过Kolmogorov-Smirnov检验评估数据分布后,我们采用lg(2-△CT)对数据进行校正。进行2组数据间的比较,采用Fisher检验,Student’s t检验。对于2组以上的比较,采用单因素方差分析。进行单变量和多变量线性回归分析来确定与lg(2-△CT)相关的变量。所有统计分析采用SPSS 22.0,数据表示为均值±标准差,所有分析均为双侧检验,P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果 2.1 基本临床资料分析

表 1显示了研究人群的基本临床资料,男性占55.31%,平均年龄(63.5±10.4)岁,高血压、糖尿病、吸烟史、血脂异常等CAD危险因素发生率分别为68.50%、21.25%、26.37%、50.55%。

表 1 基本临床资料
2.2 血浆miRNA-143/145水平与CAD的危险因素的关系

表 2显示了性别、年龄、吸烟史、高血压、糖尿病、血脂异常等受试者相关临床特征与血浆miRNA-143/145表达水平的单变量线性回归分析,其中血脂异常与低表达的血浆miRNA-143/145水平相关(P=0.045)。

表 2 血浆miRNA-143/145表达水平的单变量线性回归分析
2.3 血浆miRNA-143/145水平与冠心病的关系

与非冠心病患者相比,冠心病患者的血浆miRNA-143/145表达水平显著下降(lg miRNA-143,-2.61±0.78及-2.18±0.86,P<0.000 1;lg miRNA-145,-2.96±0.74及-2.58±0.77,P<0.000 1)。如表 3表 4,通过单变量线性回归分析,及调整冠心病危险因素,行多变量线性回归分析,发现冠心病患者中血浆miRNA-143/145水平显著降低。

表 3 血浆miRNA-143/145表达水平与冠心病严重程度的单变量线性回归分析
表 4 血浆miRNA-143/145表达水平与冠心病严重程度的多变量线性回归分析
2.4 血浆miRNA-143/145水平与冠状动脉病变严重程度的关系

将有冠脉病变的207名患者分为轻、中、重三类,以确定血浆miRNA-143/145的血浆水平与冠状动脉病变严重程度之间的关系,通过冠脉造影,轻度病变有51例(24.64%),中度57例(27.54%),重度(47.83%),重度病变患者血浆miRNA-143/145水平明显低于轻度病变患者(P=0.041;P=0.02),但轻、中度病变(P=0.786;P=0.442)及中、重度病变(P=0.089;P=0.140)之间没有显著差异(见图 1AB)。如表 3表 4,通过单变量(P=0.028;P=0.014)和多变量线性回归(P=0.033;P=0.025)分析可知冠脉病变严重度与血浆miRNA-143/145下降程度显著相关。

图 1 血浆miRNA-143/145水平与冠状动脉病变严重程度的关系

将通过冠脉造影后确诊为心肌桥(7例)、无冠脉病变患者(59例)或冠状动脉粥样硬化(Coronary atherosclerosis,CAS)患者(51例)进行比较,相比仅为心肌桥的患者(P=0.033;P=0.012),冠状动脉粥样硬化患者的血浆miRNA-143/145水平显著下降,而对于冠脉无病变的患者,冠状动脉粥样硬化患者的血浆miRNA-143水平显著下降(P=0.011),心肌桥患者与冠脉无病变的患者的血浆miRNA-143/145水平无显著差异(P=0.512;P=0.120),见图 1CD。如表 3表 4,通过单变量(P=0.006;P=0.049)和多变量线性回归(P=0.012;P=0.026)分析可知冠脉粥样硬化患者较正常人群及心肌桥患者,与血浆miRNA-143/145下降程度显著相关。

2.5 血浆miRNA-143/145水平与冠状动脉病变支数的关系

根据冠状动脉病变支数进行分类,其中1、2、3支血管病变分别为64例、47例及96例患者。如图 2,冠脉无狭窄患者(66例)的血浆miRNA-143水平与1、2、3支血管病变的患者之间的差异有显著性(P=0.012,P=0.026,P<0.000 1),而血浆miRNA-145水平与2、3支血管病变的患者间差异有显著性(P=0.026,P<0.000 1)。1、2支血管病变的患者血浆miRNA-143/145水平无显著差异(P=0.808;P=0.254),而2、3支(P=0.018;P=0.024)及1、3支(P=0.001;P<0.000 1)血管病变的患者血浆miRNA-143/145水平间差异有显著性。如表 3表 4,通过单变量(P<0.001;P<0.001)和多变量线性回归(P<0.001;P<0.001)分析可知冠脉病变支数增多与血浆miRNA-143/145水平下降显着相关。

图 2 血浆miRNA-143/145水平与冠状动脉病变支数的关系
2.6 血浆miRNA-143/145水平与SYNTAX评分之间的关系

根据SYNTAX评分进行分类,分成三组:<23(n=185),23-32(n=18),>32(n=4)。如图 3,<23组与>32组之间的血浆miRNA-143/145水平有显著差异(P=0.026;P=0.043),<23组与23-32组间差异不显著(P=0.841;P=0.588),miRNA-143的23-32组及>32组间差异显著(P=0.018),而miRNA-145不显著(P=0.103)。如表 3表 4,通过单变量(P=0.028;P=0.038)和多变量线性回归分析(P=0.038;P=0.041)可知,高SYNTAX评分与低表达的miRNA-143/145水平相关显着相关。

图 3 血浆miRNA-143/145水平与SYNTAX评分之间的关系
2.7 血浆miRNA-143/145水平与疾病类型之间的关系

图 4,根据疾病类型分组:NON-CAD(n=66),SA(n=59),UA/NSTEM(n=137),STEMI(n=11)。其中STEMI患者较NON-CAD、SA、UA/NSTEM三组,其血浆miRNA-143/145水平显著降低(P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.012;P<0.000 1,P<0.000 1,P=0.002)。如表 3表 4,通过单变量(P=0.002;P=0.001)和多变量线性回归分析(P=0.002;P=0.002)可知,高SYNTAX评分与低miRNA-143/145表达水平相关显着相关。同时,miRNA-143/145可以区分SA和UA/NSTEM患者(P<0.000 1;P=0.007),但是NON-CAD及SA两组间无显著差异(P=0.072;P=0.110)。

图 4 血浆miRNA-143/145水平与疾病类型之间的关系
3 讨论

在冠状动脉粥样硬化过程中,VSMC发挥了重要作用,对于确定预防和治疗动脉粥样硬化的治疗靶点至关重要[10]。miRNA-143/145选择性地高表达于VSMC,体外研究表明,鼠VSMC在受到各种致动脉粥样硬化刺激时可以进行表型转换[11],而miRNA-143/145在调控VSMC表型中具有关键作用[12, 13]。此外,miRNA-143/145可以减缓动脉粥样硬化病变形成[14],增加miRNA-145的表达可以促使斑块稳定[15]。这些结果表明miRNA-143/145在动脉粥样硬化斑块的发病机理中起关键作用。

本研究表明血浆miRNA-143/145表达水平与冠心病严重程度显著相关,随着冠状动脉病变程度加重,病变血管增多及SYNTAX评分增加,血浆miRNA-143/145表达水平随之下降,同时STEMI患者较其他患者,血浆miRNA-143/145表达水平显著下降,此外miRNA-143/145表达水平还可以有效区分SA和UA/NSTEM患者,在对冠心病的危险因素进行调整后,仍显示血浆miRNA-143/145水平与冠状动脉病变严重程度呈负相关,这与其他文献描述的趋势相同[16, 17]。同时,本研究还分析了冠状动脉粥样硬化患者与仅为心肌桥或正常患者间的差异,发现前者的血浆miRNA-143/145表达水平较低,这有利于在临床上进行区分,并对轻度病变患者进行药物干预,预防冠脉病变进一步加重。以上研究结果说明血浆miRNA-143/145可被用于预测冠心病严重程度,尤其是对轻度病变患者有重要的预测价值,且miRNA-143/145广泛存在于外周血中,稳定性较好,可作为评估冠脉粥样硬化程度的生物标志物。

循环miRNA作为冠心病的诊断和预后的生物标志物具有巨大的前景,然而,尽管RT-PCR检测已经在部分医院开展,miRNA的检测方法仍缺乏共识,包括miRNA的提取及检测、外参选择、数据分析等方面存在多样化[18],本研究仅包含273例样本,仍需要进行大规模的多中心研究以进一步阐明miRNA-143/145作为潜在标志物的可能性。

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