武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (5): 699-703   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.003.
0

引用本文 

李行, 杨梓琪, 张光宇, 常旦琪, 钱成, 王扬淦. 心肌肥厚和心力衰竭时左心室收缩力及钙瞬变的变化[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(5): 699-703. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.003.
LI Hang, YANG Ziqi, ZHANG Guangyu, CHANG Danqi, QIAN Cheng, WANG Yanggan. Changes of the Contraction and Calcium Transients in Myocytes of Left Ventricle in Patients with Cardiac Hypertrophy and Heart Failure[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(5): 699-703. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.003.

作者简介

李行,男,1993-,医学硕士生,主要从事心衰发病机制及其治疗的研究

通讯作者

王扬淦,男,1963-,医学博士,教授,博士生导师,主要从事心衰发病机制及其治疗的研究

文章历史

收稿日期:2017-03-21
心肌肥厚和心力衰竭时左心室收缩力及钙瞬变的变化
李行 , 杨梓琪 , 张光宇 , 常旦琪 , 钱成 , 王扬淦     
武汉大学中南医院心内科 湖北 武汉 430071
[摘要] 目的: 研究心肌肥厚和心力衰竭时左心室收缩力及钙瞬变的变化。方法: 采用主动脉缩窄术构建压力负荷型心衰小鼠模型及心肌肥厚小鼠模型,小动物超声机测量小鼠心室壁厚度及射血分数,Langendorff灌流术分离小鼠左心室心肌细胞,高速CCD摄像机系统和双激发荧光倍增系统同步测量左心室心肌细胞肌小节收缩舒张功能和胞内钙瞬变。结果: 与假手术组相比,肥厚小鼠心室壁明显增厚,胞质基础钙浓度、钙瞬变振幅增高,钙瞬变达峰时间、恢复时间和肌小节舒张时间明显延长,肌小节初长度缩短;心衰组小鼠心腔扩大,射血分数(EF)、钙瞬变峰值、峰高、达峰时间及胞质内钙恢复的速度明显下降,肌小节初始长度显著缩短,收缩幅度下降,静息期基础钙浓度显著上升,收缩及舒张时间均明显延长。结论: 在心力衰竭的发展过程中,随着心脏结构的改变,心肌细胞对胞内钙的释放和回收能力均下降,使单个心肌细胞收缩无力、舒张时间延长,进而影响整个心脏的收缩舒张功能。改善心肌细胞钙循环可能在缓解心衰患者临床症状和改善预后方面起到关键作用。
关键词心肌肥厚    心力衰竭    钙瞬变    肌小节收缩    
Changes of the Contraction and Calcium Transients in Myocytes of Left Ventricle in Patients with Cardiac Hypertrophy and Heart Failure
LI Hang, YANG Ziqi, ZHANG Guangyu, CHANG Danqi, QIAN Cheng, WANG Yanggan     
Dept. of Cardiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
[Abstract] Objective: To study the alterations of contraction and calcium transients of left ventricular myocytes in mice with cardiac hypertrophy and heart failure. Methods: Cardiac hypertrophy and heart failure in C57/BL6 mice were induced by severe thoracic aortic banding (sTAB). The ventricular wall thickness of mice were measured by using ultrasound. Myocytes were isolated from mice by Langendorff perfusion. Sarcomere contraction and Ca2+ transient were recorded simultaneously using a high speed CCD video camera and a dual excitation fluorescence photomultiplier system. Results: Compared with normal mice, ultrasonic examination of cardiac hypertrophic mice showed significantly increased left ventricular wall thickness. Calcium transient manifested remarkable increases in baseline calcium, peak height of calcium, time to peak, and tau value, with a significant decrease in original sarcomere length. Compared with normal mice, ultrasonic examination showed significantly expanded left ventricular internal diameter (LVID) and decreased ejection fraction (EF) in heart failure mice. Calcium transient manifested substantial increase in baseline calcium, while the peak and peak height of calcium, time to peak, tau value, and the original sarcomere length reduced. Conclusion: During the course of heart failure, the release and recycling of intracellular calcium were both decreased in cardiac myocytes along with the development of cardiac remodeling, which weakens the contraction and prolongs the relaxation time in single cardiac myocyte, thus affecting the systolic and diastolic function of the whole heart. The improvement of myocardial calcium cycling may play a key role in relieving clinical symptoms and improving prognosis in patients with heart failure.
Key words: Hypertrophy    Heart Failure    Calcium Transient    Sarcomere Contraction    

心肌肥厚是心脏对缺血缺氧、压力或容量超负荷等应激的代偿性反应,主要表现为心肌细胞肥大、凋亡增多和心肌组织纤维化[1];心肌肥厚进一步失代偿将发展为心力衰竭,特征为心排量降低、器官和组织灌注不足、肺循环或体循环的被动性充血[2]。引起心肌细胞收缩的钙主要来源于心肌细胞内肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)。在舒张期,心肌细胞胞质中的Ca2+通过SR上的Ca2+泵(sareo/endoplasic Ca2+ATPase,SERCA2a)重新被SR回收储存,以保证下次收缩时SR的钙容量。发生心肌肥厚和心衰时,SR释放、回收和储存钙离子的过程异常致使心肌细胞内钙循环紊乱,导致心肌收缩力及钙瞬变的变化。本实验以C57BL6小鼠心衰及肥厚模型作为研究对象,运用高速CCD摄像机系统和双激发荧光倍增系统对左室心肌细胞动态肌小节长度及胞质内钙瞬变变化进行测量,以期了解慢性心衰从代偿到失代偿过程中单个心肌细胞收缩力及钙瞬变的阶段性改变。从而为揭示心力衰竭发生过程中心肌细胞内钙循环的异常提供更为直接的证据。

1 材料与方法 1.1 材料

6-8周龄C57/BL6雄性小鼠,购于武汉大学医学部实验动物中心。荧光染料fura-2AM购于InvitrogenTM公司。单细胞收缩功能及钙瞬变检测系统购买于美国IomOptix公司。小动物超声仪(VERO 2100) 购买于加拿大VisualSonics公司。

1.2 试剂

KB液(mmol/L):K-glutamate 100,KCl 25,KH2PO4 10,MgSO4 1,Glurose 22,EGTA 0.5,HEPES 5,KOH调整pH至7.2。KR液(mmol/L):NaCl 35,KCl 4.75,KH2PO4 1.19,NaH2PO4·H2O 16,Sucrose 134,NaHCO3 25,Glucose·H2O 10,HEPES 10,NaOH调整pH至7.4。台式液(mmol/L):NaCl 137,KCl 5.4,MgCl2·6H2O 1.2,HEPES 10,Glucose·H2O 10,Na2HPO4·12H2O 1.2,CaCl 1.8,NaOH调整pH至7.4。

1.3 小鼠心衰及肥厚模型的建立

选取6-8周龄C57BL/6小鼠,分为心衰手术组(n=10)、肥厚手术组(n=10) 和假手术组(n=10)。手术组小鼠采用戊巴比妥钠(80 mg/kg)腹腔注射麻醉,取仰卧位固定于小手术台,胸部剪毛备皮,常规酒精消毒后在胸骨左缘开2-3 mm切口。在头臂干与左颈动脉之间,用7-0聚丙烯缝线环绕主动脉弓,27 Gauge(肥厚组)或28 Gauge(心衰组)针头与主动脉弓平行放置,结扎后快速抽出针管,造成主动脉缩窄。假手术组除未结主动脉弓外,其余步骤均与手术组相同。模型建立1周后,超声测量小鼠射血分数(EF),心室壁厚度等指标,测量结束后立即取出大鼠的心脏进行心重体重比(HW/BW)的计算。

1.4 单个心室肌细胞的分离

戊巴比妥钠加肝素钠(1 000个单位)腹腔注射麻醉小鼠。开胸取出心脏,置于预热至37 ℃并氧合5 min的KR液中。主动脉插管结扎后将心脏悬挂于Langendorff灌流系统,KB液加0.8 mg/ml的胶原酶灌流25 min后取下心脏,去除心房及右心室组织,剪碎,过滤,溶于KB液中,即得到左心室心肌细胞悬浮液。

1.5 胞内钙浓度和肌小节长度测量

取1.5 μmol/L fura-2 AM加入1.5 ml心肌细胞悬浮液中,室温下避光静置12 min后弃上清液,台氏液洗涤细胞后,将细胞悬液移入灌流槽中,待细胞吸附后,选取边缘干净,横纹肌清晰,跟随外界电刺激频率稳定收缩的心肌细胞成像于电脑显示屏,并用台氏液持续灌流,调节荧光检测窗口使之与细胞边缘重合,选择胞内清晰的6-8个肌小节,分别监测正常、心肌肥厚、心力衰竭小鼠单个心肌细胞收缩功能及细胞内钙瞬变(F340/F380)情况。

1.6 数据的读取

肌小节收缩图形的振幅反映肌小节收缩力。钙瞬变图形的基线值反映心肌细胞舒张期胞质内钙浓度,即肌浆网自发的钙释放;钙瞬变图形的振幅反映心肌细胞收缩期胞质内钙浓度,即钙触发的肌浆网钙释放。

1.7 统计学方法

所有实验数据以x±s表示,采用SPSS 19.0软件,进行t检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 2组小鼠心功能的比较

手术组小鼠采用主动脉缩窄术结扎小鼠主动脉弓构建心衰及肥厚模型,心衰组术时死亡1只,术后死亡4只,于术后24-48 h死亡,1周后存活5只,肥厚组术后死亡3只,1周后存活7只,假手术组小鼠术后未见死亡。手术1周后,对其心率、EF值、心重体重比等各项指标进行测量,以左心室后壁厚度>1 cm为标准判定心肌肥厚,以心腔明显扩大、EF值<50%为标准判定心力衰竭[3]。结果显示,与假手术组比较,心衰组超声图像显示心腔明显增大,EF值显著下降(P<0.01),HW/BW明显增加(P<0.01);肥厚组心室后壁明显增厚(P<0.01),HW/BW增加(P<0.01),提示造模成功。超声结果见表 1

表 1 术后1周3组小鼠超声参数
2.2 心肌肥厚、心力衰竭时单个心肌细胞钙瞬变的变化

以小鼠超声后所得EF<50%作为心力衰竭的判断标准,左心室后壁舒张期厚度>1 cm作为心肌肥厚的判断标准,统计了7只正常C57/BL6小鼠左心室的50个心肌细胞、5只心衰小鼠左心室的60个心肌细胞和3只肥厚小鼠的50个心肌细胞。在电刺激频率为1 Hz,台式液持续灌流情况下,比较3组心肌细胞钙瞬变之间的差异(图 1)。结果发现与正常组相比,心衰组胞内基础钙浓度明显上升(P<0.01),钙瞬变达峰速度、峰值、峰高及恢复速度下降(P<0.01);肥厚组基础钙浓度和钙瞬变振幅增高(P<0.01),达峰及恢复时间明显延长(P<0.01)。与肥厚组相比,心衰组舒张期胞质钙浓度明显上升(P<0.01),钙瞬变峰值、峰高下降(P<0.01),钙释放和回收的速度减慢(P<0.01),详见表 2

图 1 3组单个左心室心肌细胞钙瞬变
表 2 3组单个左心室心肌细胞钙瞬变的差别
2.3 心肌肥厚、心力衰竭时单个心肌细胞肌小节动态长度的变化

在电刺激频率为1 Hz,台式液持续灌流情况下,比较3组心肌细胞肌小节长度动态变化之间的差异(图 2)。结果发现,相比正常组,心衰组左室心肌细胞肌小节初长度明显缩短(P<0.01),收缩幅度及收缩、舒张速度下降(P<0.01);肥厚组肌小节初长度缩短(P<0.01),舒张时间延长(P<0.01)。与肥厚组相比,心衰组小鼠肌小节初始长度明显缩短(P<0.01),收缩幅度下降(P<0.01)。详见表 3

图 2 3组单个左心室心肌细胞肌小节收缩
表 3 3组单个左心室心肌细胞肌小节长度变化的差别
3 讨论

本研究发现心衰小鼠静息期胞质内钙浓度明显上升,Ca2+浓度达到峰值的时间和恢复时间均明显延长;心肌细胞肌小节初长度缩短、收缩无力、舒张时间延长。肥厚小鼠心脏心室壁增厚明显,舒张期钙浓度上升,胞质钙达峰时间和恢复时间延长;心肌细胞肌小节初长度缩短、收缩无力、舒张时间延长,但变化程度不及心衰组。

主动脉缩窄术(TAC)之前主要被用于构建小鼠的心肌肥厚模型,该模型在主动脉弓上头臂干和左颈总动脉分支之间造成27 gauge的狭窄,使小鼠发展为心肌肥厚(心脏重量增加40%且不伴有左心功能减退及心衰症状)。而我们实验室在前期实验中发现,使用28 gauge针头稍加大主动脉弓狭窄程度后,小鼠表现为极度的左心功能失代偿(左心室心腔扩大,EF值急剧下降和循环衰竭)。这种模型可以很好地反映急性压力负荷时心脏的一系列生理变化[3]

心肌细胞钙循环主要包括肌浆网的钙释放及钙回摄两个重要过程。钙释放主要涉及心肌细胞膜上的L型钙通道(L-Type Calcium Channels,LTCC)和肌质网上的雷尼丁受体(RyR2)。心肌细胞膜发生去极化时, 少量钙离子通过LTCC进入细胞胞质,与RyR2结合并使其开放,使大量的钙离子从SR中释放出来,即钙诱导钙释放(Ca2+ Induced Ca2+ Release,CICR)[4]。进人肌质中的Ca2+与肌钙蛋白结合引起细胞收缩,从而完成心肌细胞的兴奋收缩偶联(excitation-contraction coupling,ECC),此过程中的Ca2+绝大部分由心肌细胞内的SR提供[5]

近年来,许多研究者发现心衰时胞质内钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKⅡ)水平上调,导致肌质网RyR2受体过度磷酸化,使其在舒张期异常开放或者关闭不全,从而引起钙离子异常释放,即钙渗漏(calcium leak)[6]。钙渗漏引起收缩间期胞质内钙离子浓度上升,使钙瞬变基值上升,并与肌钙蛋白结合增多,导致心肌细胞舒张不完全、肌小节长度缩短。与此同时,钙渗漏的增加导致SR内钙容量(calcium content)减少。有研究资料表明,心肌细胞收缩力的强弱与胞质内钙瞬变峰值有关[7]。SR内钙容量减少导致瞬时钙释放量减少,使心肌收缩力下降。有研究表明心衰大鼠心肌细胞的L型钙电流(ICa·L)显著低于对照组,证明心衰组大鼠的心肌细胞的LTCC功能出现了异常[8]。经LTCC的钙内流是肌浆网的主要触发信号,故可能是心肌细胞收缩力下降的原因之一。本次试验测量的心衰细胞钙瞬变峰值及达峰速度均下降,进而引起肌小节收缩无力。肥厚组心肌细胞尚处于代偿期,仅表现为舒张时间延长和舒张期胞内钙浓度轻微上升。

心肌收缩后,SERCA2a将胞质内游离的钙重新回收到SR中储存。当胞质内游离钙离子低于10-7mol/L时,肌球蛋白和肌动蛋白分离,引起心肌舒张[9]。在鼠类心肌中,心脏舒张期约90%的Ca2+是通过SERCA2a转运至SR[10]。然而有研究表明慢性心衰患者患者心肌细胞内钠-钙交换(NCX)增加,SERCA2a减少[11]。从而使心肌细胞钙回溯的效率大幅下降,导致心肌细胞舒张时间延长,最终引起心衰患者心脏舒张功能下降。

综上所述,本研究记录了心力衰竭的发展过程中单个心肌细胞胞质钙浓度的变化和肌小节收缩的动态改变,为揭示心衰时心肌细胞内钙循环异常提供了更为直接的证据。本研究结果显示,心衰时钙漏的增大和各种钙通道数量及活性的改变,导致心肌细胞钙循环紊乱,心肌细胞收缩无力、舒张不全、顺应性下降,从而产生一系列的临床症状。因此改善心肌细胞钙循环可作为缓解心衰患者临床症状和改善预后方面的新靶点,为以后的临床治疗提供新的研究方向。

参考文献
[1] Diwan A, Wansapura J, Syed FM, et al. Nix-mediated apoptosis links myocardial fibrosis, cardiac remodeling, and hypertrophy decompensation[J]. Circulation, 2008, 117(3): 396-404. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.107.727073.
[2] Sullivan MJ, Knight JD, Higginbotham MB, et al. Relation between central and peripheral hemodynamics during exercise in patients with chronic heart failure. Muscle blood flow is reduced with maintenance of arterial perfusion pressure[J]. Circulation, 1989, 80(4): 769-781. DOI: 10.1161/01.CIR.80.4.769.
[3] Cheng J, Xu L, Lai D, et al. Camkii inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 302: H1454-H1465. DOI: 10.1152/ajpheart.00812.2011.
[4] Ibrahim M, Navaratnarajah M, Siedlecka U, et al. Mechanical unloading reverses transverse tubule remodelling and normalises local calcium-induced calcium release in a rodent model of heart failure[J]. Eur J Heart Fail, 2012, 14(6): 571-580. DOI: 10.1093/eurjhf/hfs038.
[5] Rebbeck RT, Karunasekara Y, Board PG, et al. Skeletal muscle excitation-contraction coupling: Who are the dancing partners[J]. ? Int J Biochem Cell Biol, 2014, 48: 28-38. DOI: 10.1016/j.biocel.2013.12.001.
[6] Curran J, Tang L, Roof SR, et al. Nitric oxide-dependent activation of camkii increases diastolic sarcoplasmic reticulum calcium release in cardiac myocytes in response to adrenergic stimulation[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e87495. DOI: 10.1371/journal.pone.0087495.
[7] Clay SA, Domeier TL, Hanft LM, et al. Elevated Ca2+ transients and increased myofibrillar power generation cause cardiac hypercontractility in a model of noonan syndrome with multiple lentigines[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2015, 308(9): H1086-H1095. DOI: 10.1152/ajpheart.00501.2014.
[8] Horiuchi-Hirose M, Kashihara T, Nakada T, et al. Decrease in the density of t-tubular l-type Ca2+ channel currents in failing ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 300(3): H978-H988. DOI: 10.1152/ajpheart.00508.2010.
[9] Lopez-Lopez JR, Shacklock PS, Balke CW, et al. Local, stochastic release of Ca2+ in voltage-clamped rat heart cells: Visualization with confocal microscopy[J]. J Physiol, 1994, 480(Pt 1): 21-29.
[10] Yao A, Matsui H, Spitzer KW, et al. Sarcoplasmic reticulum and Na+/Ca2+ exchanger function during early and late relaxation in ventricular myocytes[J]. Am J Physiol, 1997, 273(6 Pt 2): H2765-H2773.
[11] Hu ST, Liu GS, Shen YF, et al. Defective Ca2+ handling proteins regulation during heart failure[J]. Physiol Res, 2011, 60(1): 27-37.